采用滴定平板技术™ 进行间接免疫荧光实验

准备：检查加样板是否反应区亲水而周边疏水？如果不是，可用湿纸巾擦拭，必要时可使用家用洗涤剂或Extran MA 01（默克公司），再用水彻底冲洗。需要消毒时，可于3％的Sekusept Extra （汉高公司）中浸泡1小时。只有当载片平衡到室温后方可打开袋子。不要触及生物薄片。按照要求用记号笔对玻片进行标记。
稀释： 按照试剂盒使用说明稀释血清标本。每次实验均需加入阳性和阴性对照。对照血清使用前必须混匀。

加样：在加样板的每个反应区加入稀释血清，避免产生气泡。滴加完所有待测标本后才开始温育（一次最多200份）。使用聚苯乙烯加样板。
加样体积:
10 µl/反应区(3 x 3 mm)
25 µl/反应区(5 x 5 mm)
70 µl/反应区(7 x 9 mm)

温育：将载片盖在加样板对应的凹槽里，反应即开始。确保每个标本均能够与生物薄片相接触，而标本之间不相互接触。室温温育30分钟。

清洗：用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。

冲洗1秒钟
小杯内浸洗5分钟

加样：将荧光标记的抗人免疫球蛋白（酶结合物）加入洁净加样板的每个反应区。完全加完所有的二抗后，方可继续温育（最多可加50个载片）。使用连续加样器。加样前应使用加样器混匀。为节约时间，可在第一步温育的同时滴加酶结合物至另一个加样板的反应区中。

加样体积:
10 µl/反应区(3 x 3 mm)
20 µl/反应区(5 x 5 mm)
60 µl/反应区(7 x 9 mm)

温育：从PBS-Tween 清洗缓冲液中取出一张载片，5秒钟内用吸水纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里。注意：为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间隙。检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后继续下一张。从现在开始，注意避免阳光直射载片。室温温育30分钟。

清洗： 用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。可在每150ml磷酸盐缓冲液中加10滴(150 µl)伊文氏蓝进行复染。

冲洗1秒钟
小杯内浸洗5分钟

封片： 在盖玻片上滴加甘油/PBS。使用聚苯乙烯封片板。从PBS-Tween 清洗缓冲液中取出一张载片，用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应区间隙。将载片的生物薄片朝下置于准备好的盖玻片上，立即检查盖玻片是否放入载片的凹槽里，如有必要，需调整位置，正确放置。然后再进行下一个载片的操作。

封片体积:
10 µl/反应区(3 x 3 mm)
10 µl/反应区(5 x 5 mm)
20 µl/反应区(7 x 9 mm)

结果判断：荧光显微镜下观察荧光。